SESSION SCIENTIFIQUE - Principe de la RT-PCR

 

Comment réalise-t-on le diagnostic du Covid-19 ? Ce diagnostic est-il fiable ? Est-il possible de l’améliorer et avec quelles techniques ? Vous trouverez quelques éléments de réponses ainsi que des liens vers les articles scientifiques pertinents à lire ci-dessous.

La méthode de diagnostic de référence du Covid-19 est la RT-PCR (Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction) à partir d’un prélèvement nasopharyngé. Cette technique de laboratoire permet de multiplier un fragment du génome du virus (ici de l’ARN) pour le rendre facilement détectable. Lors d’un test, un contrôle positif et négatif sont réalisés simultanément pour s’assurer que le test a bien fonctionné et qu’il n’y a pas de défaut technique ainsi que pour contrôler qu’il n’y a pas de contamination du test (par exemple par la personne qui manipule).

La première étape de la RT-PCR consiste à convertir l’ARN du virus (s’il est présent dans l’échantillon) en ADN. Ensuite, des amorces vont se fixer sur l’ADN pour initier la multiplication. Celles-ci ne font que quelques dizaines de bases (pour rappel, le génome d’un coronavirus fait environ 30 000 bases). Une enzyme appelé ADN polymérase va alors se déplacer sur le brin d’ADN et recréer synthétiquement un fragment du virus. Ce cycle va être répété à plusieurs reprises et le nombre de fragments d’ADN sera doublé après chacun d’entre eux. Si le virus est présent dans l’échantillon, il sera facilement détectable à la fin de la RT-PCR.

 

Comment choisit-on une amorce?

Les amorces peuvent être créées synthétiquement en laboratoire. Elles doivent être spécifiques à chaque virus étudié et ne doivent pas pouvoir s’ «accrocher» à d’autres virus, ceci afin de ne pas les amplifier s’ils sont présents dans l’échantillon. Pour le SRAS-Cov-2, les scientifiques ont tout d’abord isolé et séquencé son génome. En le comparant à d’autres virus, ils ont pu identifier plusieurs séquences de génome spécifiques au SRAS-Cov-2 et ainsi déterminer les candidats potentiels pour devenir des amorces dans le test de diagnostic de la RT-PCR. Les tests en laboratoire ont pu identifier 10 amorces (sur 375 candidats) qui représentaient des séquences situées sur 3 gènes : gène E (codant pour une protéine de l’enveloppe du virus), Gène N (codant pour une protéine de la capsule du virus) et RdRp (codant pour une enzyme capable de répliquer l’ARN du virus) [1]. 

 

Quelle est l’efficacité des tests actuellement disponibles ?

Il est rapporté qu’environ un patient sur 5 aurait un résultat négatif alors qu’il est infecté par le SRAS-Cov-2. Les chiffres exacts ne sont pas encore connus mais ces résultats préliminaires permettre de questionner l’efficacité du diagnostic du Covid-19. Il faut savoir, qu’en temps normal, obtenir une autorisation pour commercialiser un dispositif de diagnostic prend environ un an et demi. Il faut créer le dispositif, le tester en laboratoire, le comparer à un test de référence pour prouver son efficacité ainsi que le tester sur des grands échantillons de patients provenant de plusieurs centres pour le valider. Dans le cadre du Covid-19, du fait de l’urgence sanitaire, les autorités ont déterminé qu’il était raisonnable de commercialiser rapidement tout dispositif de diagnostic qui pourrait être efficace dans la détection du virus à partir du moment où ils respectent certains critères de fabrication. Ces dispositifs n’ont donc pas subit la procédure habituelle de validation et leur efficacité reste à prouver. Ils sont uniquement autorisés pour un usage d'urgence. 

 

Utilité de l’imagerie dans le diagnostic

Pour un clinicien, établir un diagnostic final est possible en additionnant plusieurs examens. La  RT-PCR n’étant pas efficace à 100%, il faut donc définir quels examens complémentaires peuvent nous aider à évaluer le risque d’un patient d’être porteur du Covid-19. En plus de l’intérêt de l’interrogatoire du médecin pour vérifier la présence de symptômes et autres facteurs de risque, un des examens les plus discutés est le scanner des poumons. 

Il a été démontré a plusieurs reprises que certains patients avec un résultat négatif à la RT-PCR présentaient des anomalies typiques du Covid-19 lors d’un scanner des poumons [2]. Dans une étude sur 1014 patients de Wuhan en Chine, 57% (n=580) des patients étaient positifs à la RT-PCR et au scanner, 30% (n=308) uniquement au scanner, 2% (n=21) uniquement à la RT-PCR et 11% (n=105) étaient négatifs aux deux tests. Le scanner a permis de reconsidérer 147 patients comme hautement probable de Covid-19, 103 comme probable et 58 restant incertains [3]. Selon une autre étude, la combinaison RT-PCR / scanner semble être celle avec la plus haute sensibilité de diagnostic (capacité à détecter les patients malades ; 92%, 79/86 patients) comparé à la RT-PCR seule (78%, 68/87), au scanner seul (67%, 54/81) ou à la combinaison de deux (86%,75/87) [4].

Nous améliorons donc en permanence notre méthode de diagnostic du Covid-19. Dernièrement, une équipe italienne a proposé l’utilisation de l’échographie des poumons comme un moyen de diagnostic rapide et moins invasif que le scanner. Leur publication propose un protocole standardisé pour son utilisation [5]. Des résultats sont attendus pour confirmer son intérêt dans le diagnostic du Covid-19.

 

Publications scientifiques pertinentes :

  1. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Corman VM, Landt O et al. Eurosurveillance, 25, 2000045 (2020)
  2. Chest CT for Typical 2019-nCoV Pneumonia: Relationship to Negative RT-PCR Testing. Xie X, Zhong Z, et al. Radiology
  3. Correlation of Chest CT and RT-PCR Testing in Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) in China: A Report of 1014 Cases. Tao A, Zhenlu Y, et al. Radiology
  4. Application and optimization of RT-PCR in diagnosis of SARS-CoV-2 infection. Jiang G, Ren X, et al. medRxiv 2020.02.25.20027755
  5. Proposal for international standardization of the use of lung ultrasound for COVID‐19 patients; a simple, quantitative, reproducible method. Soldati G, Smargiassi A, et al. J Ultrasound Med